Определение уровня чувствительности синантропных насекомых к инсектицидам
Методические указания МУ 3.5.2.2358—08

1. Область применения
Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственного санитарно-эпидемиологического надзора, разрабатывающих стратегию и тактику применения инсектицидов и занимающихся дезинфекционной деятельностью, исследованием инсектицидной активности различных веществ и препаративных форм на их основе, рекомендуемых для целей медицинской дезинсекции, а также могут быть использованы другими организациями.
2. Общие положения
Устойчивость насекомых к инсектицидам подразделяется на природную и приобретенную. Насекомые на разных стадиях развития обладают различной природной чувствительностью к инсектицидам, относящимся к разнообразным группам химических веществ. Так, куколки насекомых значительно устойчивее к действию инсектицидов по сравнению с другими стадиями развития. Чувствительность к инсектицидам зависит от физиологического состояния насекомых и может также различаться у голодных и напитавшихся особей.
Приобретенная устойчивость к инсектицидам напрямую связана с инсектоакарицидным прессом. Формирование резистентных популяций вредных организмов под воздействием пресса пестицидов является одной из центральных проблем их эффективного использования. Резистентность (приобретенная устойчивость) рассматривается как адаптация популяции определенного вида насекомых к воздействию пестицидов, и поэтому она входит в круг вопросов, относящихся к химической экологии.
Резистентность является общебиологическим понятием. В настоящее время приобретенная устойчивость к инсектоакарицидам, фунгицидам и гербицидам выявлена как у вредных, так и у полезных организмов. Среди вредных членистоногих резистентные популяции обнаружены у вредителей сельскохозяйственных культур и животных, а также у членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиени­ческое значение.
Количество видов членистоногих, у которых сформировались резистентные к инсектоакарицидам популяции, неуклонно возрастает. Если в 1945 г. были обнаружены резистентные популяции членистоногих, относящихся к 12 видам, то в 1967 г. – к 224, в 1975 г. – к 364 видам. По данным Дж. Кригер [19], более 500 видов насекомых к середине 80-х годов XX в. имели популяции, резистентные к инсектицидам.
Наиболее полный перечень видов членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение, у которых выявлены резистентные популяции, приведен в 15-м Докладе Комитета Экспертов ВОЗ [11]. Согласно этим данным у 147 видов членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение, сформировались популяции, резистентные к различным по химической структуре инсектоакарицидам. В 2000 г. сообщалось о 198 видах таких членистоногих [17]. В 2006 г. эти материалы были дополнены [12].
Определение уровня чувствительности членистоногих к используемым и рекомендуемым действующим веществам (ДВ) инсектицидов является необходимым элементом при планировании и осуществлении программ истребительных мероприятий. Резистентность – динамичное явление, развивающееся в различных пределах у разных видов и даже у одного и того же вида при различном прессе применяемых инсекти­цидов [2].
Разработанные методические указания посвящены определению уровней чувствительности основных видов насекомых, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение.
Для обнаружения и последующего мониторинга резистентности у популяций насекомых, собранных на объектах, необходимо пользоваться относительно простыми методами, позволяющими ограниченному по численности персоналу проводить исследования в короткие сроки. Оперативным методом, рекомендованным Комитетом экспертов ВОЗ по инсектицидам [14], является использование диагностических (дискриминирующих) концентраций или доз.
В основу данных методических указаний положены стандартные методы, рекомендуемые ВОЗ, в ряде случаев – модифицированные в НИИ дезинфектологии (НИИД) или в Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского (ИМПиТМ). Главным образом эти изменения касаются времени контакта насекомых с тест-поверхностями, обработанными диагностическими дозами. Согласно методам ВОЗ контакт насекомых с обработанными тест-поверхностями продолжается от нескольких часов (5—10) до нескольких суток (1—5). Однако некоторые насекомые в естественных условиях не контактируют столь длительное время с поверхностями, обработанными инсектицидами, поэтому для установления уровня чувствительности природных популяций ряда видов насекомых целесообразно определить не время контакта членистоногого с поверхностью, обработанной диагностической дозой или концентрацией, а концентрацию (дозу) инсектицида, которая за относительно короткий отрезок времени обеспечивает их максимальную смертность.
В настоящих методических указаниях изложены методы определения уровня чувствительности к инсектицидам рыжих тараканов (Blattella germanica), платяных вшей (Pediculus humanus humanus), постельных клопов (Cimex lectularius), блох на примере крысиной блохи (Xenopsylla cheopis), комнатных мух (Musca domestica), комаров (личинок и имаго) родов Culex, Aedes и Anopheles.
Изучение уровня чувствительности насекомых, собранных на объектах, позволит оптимизировать комплекс дезинсекционных меро­приятий.
2.1. Приготовление растворов инсектицидов
Для топикальной обработки насекомых используют не менее
5 концентраций ацетоновых или спиртовых растворов ДВ инсектицидов, полученных путем последовательного разбавления (с шагом разбавления 2 или другим в зависимости от необходимости).
Тест-поверхности обрабатывают, исходя из норм расхода 100 мл/м2 (1 мл/дм2) впитывающей поверхности (фанера, ткань, фильтровальная бумага и др.) и 50 мл/м2 (0,5 мл/дм2) невпитывающей поверхности (стекло). Для обработки контрольных тест-поверхностей используют те же растворители, что и в опытных вариантах.
2.2. Расчет среднесмертельных концентраций и доз
Показатели СК50 или СД50 (СК95 или СД95 и другие величины) для каждого инсектицида определяют методом пробит-анализа путем построения линии регрессии «доза-смертность» («концентрация-смертность») [10].
Для пересчета величины СК50 (СК95, 99), % в величину СД50 (СД95, 99), мкг/г определяют среднюю массу одного насекомого в мг. Для этого до опыта взвешивают не менее 50 предварительно анестезированных особей. Вычисление проводят по формуле:
, где
А – концентрация, СК50, %;
Б – объем нанесенного раствора, мкл;
B – масса насекомого, мг.
2.3. Использование диагностической концентрации
По данным экспериментов, проведенных в лабораторных условиях, рассчитывают диагностические концентрации (ДК) или дозы (ДД). Дозу или концентрацию, равную двум дозам или концентрациям, вызывающим смертность 95 % (99 %) членистоногих, считают диагностической [18].
Обработка насекомых растворами инсектицидов в диагностической концентрации должна проводиться в 3—5 повторностях. Случайное появление оставшихся в живых особей (например, в 3-х последовательных опытах) служит сигналом, указывающим на необходимость дальнейших исследований. Таким образом, можно обнаружить наличие приобретенной резистентности и установить приблизительно, какую часть в популяции членистоногих составляют резистентные особи. Если в эксперименте погибли все особи, то популяция является чувствительной. Если погибли 80 % особей, то в популяции содержится 20 % устойчивых особей и т. д. Если в эксперименте погибли 50 % особей, то популяция
является устойчивой и необходимо установить показатель резистент­ности (ПР).
Данные, полученные при использовании диагностической концентрации, можно использовать для практических целей при принятии решения о возможности использования данного инсектицида для обработки объекта. Так, если при обработке насекомых растворами инсектицидов в диагностической концентрации погибли менее 40 % насекомых, такое средство не следует использовать на данном объекте.
2.4. Критерии оценки уровня чувствительности насекомых, собранных на объектах
Оценку уровня чувствительности насекомых, собранных на объектах или с человека, проводят путем вычисления показателей резистентности (ПР) – соотношения показателей (СД50, СД95, СД99; СК50, СК95, СК99), полученных для инсектарной культуры и популяции, собранной на объекте, например:

В зависимости от величины ПР популяция оценивается как «чувствительная», «толерантная» или «устойчивая».
Поскольку уровень чувствительности к инсектицидам у членистоногих в популяциях, собранных на объектах, может значительно различаться, их относят к одной из приведенных ниже групп по степени установленной у них устойчивости. Чувствительность насекомых инсектарной культуры принимают за единицу [18].
I группа. ПР менее 1 – насекомые высокочувствительны к инсектициду.
II группа. ПР равен 1 – насекомые чувствительны к инсектициду.
III группа. ПР в пределах 2—10 – насекомые толерантны к инсектициду.
IV группа. ПР 10 и более – насекомые резистентны к инсектициду.
2.5. Статистическая обработка полученных результатов
Смертность насекомых в опыте в каждой повторности и в контроле вычисляют в процентах по отношению к общему количеству насекомых в повторности. В случае смертности в контроле 5—20 % особей в результаты опытов вводят поправку по формуле Аббота [4]. Если смертность членистоногих в контроле превышает 20 %, результаты опыта считают недействительными.
Доверительные пределы к показателям СК50 (СД50) и стандартные отклонения рассчитывают по П. В. Попову [10], П. Ф. Рокитскому [13], Г. Ф. Лакину [4] и др.
2.6. Наборы для опытов
Для проведения опытов необходима биологическая лаборатория, оснащенная термостатами, холодильниками, аналитическими весами, вытяжными шкафами и пр.
Набор для проведения опытов состоит из следующих предметов:
1) стаканы стеклянные или полимерные; 2) бутылки полимерные объемом 2 л; 3) стеклянные пластины размером (10 × 20) см; 4) чашки Петри D = 10 см; 5) чашки Петри D = 4 см; 6) часовые стекла или стеклянные чашки; 7) экспозиметры (D = 9 см) согласно МУ 3.5.2.1759—03 [9]; 8) пипетки; 9) цилиндры; 10) сосуды для отстаивания воды; 11) пробирки стеклянные химические; 12) штативы для пробирок; 13) микродозаторы (петли) или микропипетки; 14) эксгаустеры; 15) стеклянные воронки; 16) энтомологический сачок D = 4 см; 17) вазелин технический; 18) мелкоячеистая марля для завязывания стаканов; 19) крышки пластиковые с маленькими отверстиями; 20) хлопчатобумажная ткань; 21) рези­новые кольца; 22) глазной пинцет; 23) мягкий пинцет; 24) флаконы пенициллиновые с резиновыми крышками; 25) химические пробирки с пробками; 26) лейкопластырь; 27) маркер; 28) ацетон; 29) этиловый спирт; 30) эфир медицинский; 31) резиновые перчатки; 32) фильтровальная бумага (фильтры обеззоленные); 33) ножницы; 34) вата; 35) пробит-логарифмическая бумага для построения линий регрессии; 36) грифельный карандаш; 37) прозрачная линейка; 38) журнал учета данных опытов.
3. Методы определения уровня чувствительности к инсектицидам рыжих тараканов Blattella germanica
В лабораторных условиях определение уровня чувствительности и диагностической концентрации (дозы) ДВ инсектицида проводят на имаго рыжих тараканов лабораторной чувствительной культуры методом топикального нанесения инсектицида и методом контактирования с обработанными тест-поверхностями.
3.1. Установление исходного уровня чувствительности и диагностических концентраций методом топикального нанесения растворов инсектицидов
Опыты проводят на однородном биоматериале – самцах рыжих тараканов в возрасте от 5 до 15 дней после имагинальной линьки. Для определения качества биоматериала насекомых за 24 ч до начала опыта отбирают из ёмкости для выращивания и отсаживают в плоский кристаллизатор с кормом и водой.
Ацетоновые или спиртовые растворы ДВ инсектицида наносят из микропипетки или с помощью микродозатора на мезостернум (среднегрудь) анестезированных тараканов по 1 мкл на каждое насекомое. В контрольном варианте на тараканов наносят 1 мкл растворителя, использованного при приготовлении растворов инсектицида. После нанесения инсектицида насекомых помещают в чистые стаканы (стеклянные или полимерные) со смазанными вазелином краями.
Опыты проводят не менее чем в трёх повторностях для каждой концентрации. В каждой повторности используют не менее 10 насекомых, в контрольном варианте – не менее 20 особей. Опыты проводят при температуре воздуха (23 ± 2) °С и относительной влажности 50—70 %. Учёт гибели насекомых проводят через 24 и 48 ч. В категорию «поражённых» включают мертвых и парализованных насекомых. Парализованными считают тараканов, не способных к самостоятельному передвижению.

3.2. Установление исходного уровня чувствительности и диагностических концентраций методом контактирования тараканов с обработанными тест-поверхностями
Данный метод непригоден для установления уровня резистентности к ДВ инсектицидов, обладающих низкой контактной активностью, например, имидаклоприду, ацетамиприду, гидраметилнону, сульфофторамидам.
3.2.1. Метод подсадки тараканов
в обработанные стеклянные сосуды
Опыты проводят в стеклянных сосудах емкостью 0,5 л, обработанных инсектицидом за 1 сут. до опыта. На внутреннюю поверхность сосудов наносят 2,5 мл раствора ДВ инсектицида из расчета 100 мл/м2, затем сосуды вращают, равномерно распределяя раствор по внутренней стенке и дну, до полного испарения растворителя. Работу проводят в вытяжном шкафу.
Насекомых помещают в обработанные сосуды, края которых предварительно смазывают вазелином. Все концентрации инсектицида испытывают не менее чем в трех повторностях, используя не менее 10 насекомых в каждой. Контролем служат насекомые (не менее 20 особей), помещенные в сосуды, обработанные растворителем. После контакта в течение 1 ч тараканов переносят в чистые стаканы с кормом и водой. Учет смертности проводят через 24 и 48 ч.
Опыты проводят на самцах рыжих тараканов в возрасте 5—15 сут. после имагинальной линьки, при температуре воздуха (23 ± 2) °С и относительной влажности 50—70 %.
3.2.2. Метод подсадки тараканов
на обработанные стеклянные поверхности
На стеклянные поверхности – пластины стекла размером (10 × 20) см наносят ацетоновые растворы ДВ инсектицидов из расчета 50 мл/м2 (1 мл на пластину) и высушивают в горизонтальном положении. Все концентрации инсектицида испытывают не менее чем в трех повторностях, используя по 10 насекомых в каждой. Контролем служат насекомые (не менее 20 особей), помещенные на пластины, обработанные растворителем.
Контакт тараканов с обработанными поверхностями осуществляют в течение 1 ч в больших экспозиметрах (D = 9 см), нижний край которых смазан вазелином (МУ 3.5.2.1759—03) [9]. После контакта с обработанными пластинами насекомых переносят в чистые сосуды со смазанными вазелином краями и регистрируют их состояние через 24 и 48 ч.
Опыты проводят на самцах рыжих тараканов в возрасте 5—15 сут. после имагинальной линьки, при температуре воздуха (23 ± 2) °С и относительной влажности 50—70 %.
3.3. Метод определения уровня чувствительности к инсектицидам популяций рыжих тараканов, собранных на объектах
Отлов насекомых на объектах проводят с помощью банок-ловушек или пластиковых ловушек различной конструкции, в которых отловленные тараканы остаются живыми. Перед расстановкой банок-ловушек их края смазывают тонким слоем вазелина, на дно помещают приманку (хлеб с подсолнечным маслом и пивом), банку обвязывают узкой полоской марли или ткани так, чтобы один конец находился на полу рядом с банкой, а другой – внутри, не доставая дна банки. Банки расставляют в местах обитания тараканов на 48—72 ч.
Отловленных насекомых помещают в емкости для культивирования с укрытиями из картона в виде трубок или гармошек, кормом и водой. Для проведения опытов из ёмкости для культивирования отбирают личинок первого поколения (F1) 5—6 возраста и помещают в отдельный сосуд, из которого затем выбирают самцов рыжих тараканов в возрасте 5—15 дней после имагинальной линьки.
При определении уровня чувствительности популяций рыжих тараканов, собранных на объектах, используют методы, указанные в п.п. 3.1 и 3.2. Первичную оценку уровня чувствительности популяции к ин­сектицидам проводят методом контактирования с использованием диагностических концентраций (п. 3.2, более точное определение уровня чувствительности – методом топикального нанесения микродоз препа­рата (п. 3.1).
4. Методы определения уровня чувствительности
к инсектицидам платяных вшей Pediculus humanus humanus
4.1. Метод определения чувствительности вшей
к педикулицидам и установления диагностической концентрации
в лабораторных условиях
Опыты проводят на однородном биологическом материале – платяных вшах чувствительной лабораторной культуры (Pediculus humanus humanus, синонимы – Pediculus vestimenti и Pediculus corporis). В опытах используют сытых насекомых (накормленных за 2—3 ч до постановки опыта) без разделения по полу, в возрасте 7 дней. Хлопчатобумажную ткань (бязь) размером (10 × 10) см обрабатывают серией спиртовых растворов разных концентраций инсектицида при норме расхода 1 мл на 100 см2. Затем ткань высушивают в течение 15—60 мин, нарезают на кусочки размером (3 × 4) см и помещают в стеклянные сосуды [14]. На обра­ботанные образцы ткани с помощью пинцета подсаживают имаго вшей (не менее 10 особей на каждый образец). Каждый опыт ставят не менее чем в 3 повторностях. Контрольных насекомых (не менее 20 особей) содержат на ткани, обработанной растворителем. Время контакта имаго вшей с обработанной тканью составляет 15 мин. После окончания экспозиции насекомых пинцетом переносят на необработанную ткань в чистые стаканы или чашки Петри, которые затем до окончания опыта помещают в термостат (температура (28 ± 2) °С, относительная влажность 75 %). Учет смерт­ности насекомых проводят через 24 ч. В категорию «пораженных» включают мертвых и парализованных вшей. Рассчитывают величины СК50, СК99, г/м2 и диагностическую концентрацию, равную (СК99 × 2), г/м2.

4.2. Модифицированный метод ВОЗ
Модификация метода ВОЗ предложена B. Zeichner [20]. Чувствительных платяных вшей лабораторной популяции помещают в чашки Петри, выстланные фильтровальной бумагой, обработанной спиртовыми растворами инсектицидов. Через 6 ч чашки переворачивают и слегка постукивают ими по столу. Вшей, которые не могут держаться на поверхности бумаги, считают парализованными (в состоянии нокдауна). Величины концентраций, вызывающих нокдаун (паралич) у 50 и 99 % особей вшей – КН50 и КН99, мг/мл, полученные этим методом, приведены в табл.

Поскольку головные вши Pediculus humanus capitis более чувствительны к инсектицидам, чем платяные, диагностические концентрации, рекомендованные для платяных вшей, можно использовать и для выявления резистентности в популяциях головных вшей. Если при этих концентрациях в выборке из популяции будут выжившие особи, то популяция резистентна к изучаемому педикулициду, и его следует заменить на другой, содержащий в качестве ДВ инсектицид из другого класса химических соединений.
4.3. Метод определения уровня чувствительности к инсектицидам вшей, собранных на людях, одежде или в помещениях
Методика определения чувствительности к инсектицидам популяций вшей, собранных на людях, одежде и в помещениях, основана на установлении величины смертности от диагностической концентрации (в %), а также величин СК50 и СК99 при контакте с тканью, обработанной серией растворов инсектицида. В опытах используют половозрелых вшей обоего пола, непосредственно после сбора насекомых с одного или нескольких человек (или с их вещей). Вид собранных вшей определяют по методическим рекомендациям «Вши человека» [5].
Спиртовым раствором инсектицида в диагностической концентрации обрабатывают ткань размером (10 × 10) см при норме расхода 1 мл/100 см2. Ткань высушивают, разрезают на кусочки размером (3 × 4) см, помещают в чистые сосуды. С помощью пинцета переносят от 5 до 30 особей вшей на каждый кусочек ткани в зависимости от общего числа собранных насекомых. Каждый опыт ставят не менее чем в трех повторностях. В контрольном варианте насекомых помещают на необработанную ткань. Сосуды с насекомыми содержат в термостате при температуре воздуха (28 ± 2) °С и относительной влажности 70—75 %. Учет смертности насекомых проводят через 24 ч.
Критерием чувствительности к инсектицидам популяции вшей служит смертность от диагностической концентрации (в %). Для точного установления уровня резистентности определяют показатель резистентности. Для установления показателей резистентности рекомендуется иметь стандартную чувствительную культуру вшей или использовать базовые показатели СК50 и СК99, г/м2 и диагностические концентрации для чувствительной культуры вшей (табл. 3).
5. Метод определения уровня чувствительности
к инсектицидам постельных клопов Cimex lectularius
5.1. Метод определения уровня чувствительности клопов
к инсектицидам в лабораторных условиях
В сухие чистые химические пробирки с полосками бумаги размером (1 × 5) см, сложенными в виде «гармошки», помещают по 10 имаго клопов без разделения по полу. Клопы должны быть одинаковыми по размеру и степени накормленности. Готовят серии ацетоновых растворов ДВ инсектицидов. Концентрации подбирают так, чтобы можно было рассчитать величины СК50 и СК95, % и СД50 и СД95, мкг/г массы насекомого. По величине СК95 (СД95) рассчитывают диагностическую концентрацию, равную удвоенной СК95, %. Клопов переносят в стеклянные чашки Петри и обрабатывают растворами инсектицидов, начиная с наименьшей концентрации. Растворы наносят микродозатором или микрошприцем каплями объемом 0,5 мкл на вентральную часть тела насекомого. После нанесения раствора каждое насекомое мягким пинцетом переносят обратно в этикетированные пробирки. Повторность экспериментов трехкратная, по три пробирки оставляют в качестве контрольных (без обработки) и обработанных растворителем. Учет смертности проводят через 24 ч после обработки.

5.2. Метод определения уровня чувствительности к инсектицидам популяций клопов, собранных на объектах
Для оценки степени чувствительности популяций клопов, собранных на объектах, их топикально обрабатывают раствором выбранного инсектицида в диагностической концентрации, как указано в п. 5.1. При наличии выживших особей, определяют величины СК50 (СД50) или СК95 (СД95) и показатель резистентности.
При наличии в лаборатории стандартной чувствительной культуры постельных клопов, величины СК50 (СД50) или СК95 (СД95) определяют параллельно на насекомых, собранных на объекте, и чувствительных насекомых из культуры. В том случае если лабораторная культура отсутствует, используют для сравнения базовые показатели чувствительности (табл. 5).
6. Метод определения уровня чувствительности
к инсектицидам крысиных блох Xenopsylla cheopis
Метод предназначен для установления величин СК50 (СК95) и диагностической концентрации инсектицидов для чувствительной лабораторной культуры крысиных блох. Метод не рекомендуется для установления уровня чувствительности блох к тиаметоксаму, СК50 которого составляет более 1 %. Следует подчеркнуть, что метод не предназначен для оценки эффективности отложений препаративных форм инсектицидов. Для этой цели должны быть использованы другие энтомотоксикологические методы.
6.1. Установление исходного уровня чувствительности
к инсектицидам имаго блох
Взрослых блох лабораторной культуры подсаживают на кусочки фильтровальной бумаги, обработанные ацетоновыми растворами ДВ инсектицида в разных концентрациях, определяют смертность (в %), вызванную каждой из этих концентраций. В предварительных опытах используют серию концентраций (4—5). Время контакта составляет 1 ч. Учет смертности проводят через 24 ч.
Последующие опыты проводят на основе полученных данных. Выбирают 5—7 концентраций таким образом, чтобы они вызывали смертность в пределах 15—99 %. Опыты повторяют не менее 3 раз. В экспериментах используют взрослых блох без разделения по полу. Рассчитывают величины СК50 (СК95), %. Эти данные являются основой для последующего расчета диагностической концентрации и показателя резистентности.
Приготовление импрегнированной инсектицидом бумаги. В колбах с притертыми пробками готовят серию ацетоновых растворов ДВ инсектицида с шагом разбавления, равным 2. Фильтровальную бумагу размером (10 × 10) см размечают карандашом на 20 частей размером (5 × 1) см и маркируют. Затем размеченную бумагу кладут на стеклянную поверхность и равномерно наносят 1 мл раствора инсектицида определенной концентрации. После полного испарения растворителя бумагу разрезают и используют для эксперимента или упаковывают в полиэтиленовый пакет. Использовать импрегнированную бумагу следует не позднее трех суток после изготовления при хранении в заклеенных пакетах.
Методика проведения опытов. Блох, по возможности накормленных, рассаживают по 10 особей в чистые пробирки, которые ставят вертикально в штатив. В каждую пробирку помещают бумажный тест, импрегнированный инсектицидом. В контроле используют бумажный тест, импрегнированный только растворителем. После этого штатив убирают в темный термостат (температура 28—30 ºС, относительная влажность 50—70 %). Через 1 ч из пробирок вынимают бумажные тесты в том же порядке, в каком они были туда помещены. Через 24 ч подсчитывают смертность блох. Блох, неспособных к передвижению, относят к погибшим.
6.2. Метод определения уровня чувствительности к инсектицидам популяций крысиных блох, собранных на объектах
Крысиных блох отлавливают в помещениях, которые или постоянно обрабатываются инсектицидами, или предназначены для обработки. Выловленных блох содержат в емкостях с песком в термостате при температуре 28—30 ºС и относительной влажности 50—70 %. В качестве прокормителей используют лабораторных мышей.
Если отловлено недостаточное для проведения эксперимента количество блох, то получают от них потомство, и опыты проводят на блохах 1-го поколения (F1).
При определении уровня чувствительности крысиных блох, собранных на объекте, к инсектициду, для которого установлена диагностическая концентрация, в опыте используют бумагу, импрегнированную ацетоновым раствором инсектицида в этой концентрации. Дальнейшие исследования проводят по этапам, изложенным в п. 6.1, находят величины СК50 или СК95 и рассчитывают показатель резистентности.

7. Методы определения уровня чувствительности
к инсектицидам комнатных мух Musca domestica
7.1. Метод установления уровня чувствительности и диагностической концентрации (дозы) инсектицида для имаго комнатных мух лабораторной чувствительной культуры
путем топикального нанесения растворов инсектицидов
Метод топикального нанесения рекомендуется использовать для установления уровня чувствительности комнатных мух к инсектицидам, обладающим выраженным контактным действием. Метод неприменим для работы с соединениями, не обладающими контактным действием для данного вида насекомых (например, имидаклопридом, СК95 которого превышает 1 %).
В опытах используют 3—4-дневных комнатных мух чувствительной лабораторной культуры без разделения по полу. Ацетоновый раствор ДВ инсектицида с помощью микродозатора или микропипетки наносят по 1 мкл на среднеспинку мух. В опыте используют мух, предварительно анестезированных эфиром или охлажденных в холодильнике. В контрольном варианте на мух наносят 1 мкл растворителя. При установлении показателей СК50 (СК95) проводят 3 опыта не менее чем в
3 повторностях, используя не менее 60 насекомых на одну концентрацию; в контрольном варианте используют не менее 30 насекомых. После нанесения растворов инсектицида или растворителя мух по 20 особей помещают в стаканы (стеклянные или полимерные), которые закрывают марлевыми салфетками, смоченными водой, или на салфетку помещают увлажненную вату. Салфетки закрепляют резиновыми кольцами. Опыты проводят при температуре воздуха (23 ± 2) °С и относительной влажности 50—70 %. Учет смертности насекомых проводят через 24 ч. Мух, лежащих на спине, неспособных самостоятельно перевернуться и ползать, относят к погибшим.

7.2. Метод установления уровня чувствительности и диагностической концентрации инсектицида для имаго
комнатных мух лабораторной чувствительной культуры
при кишечном воздействии
Метод рекомендуется для определения уровня чувствительности комнатных мух к ДВ, обладающим выраженным кишечным действием и не имеющим репеллентного действия в отношении этих насекомых.
В опытах используют голодных комнатных мух 3—4-дневного возраста чувствительной лабораторной культуры без разделения по полу. За 16 ч до начала эксперимента у мух отнимают корм, оставляя в садках только воду. Ацетоновыми растворами ДВ инсектицида обрабатывают сахарный песок из расчета одна часть раствора на две части сахарного песка. Сахарный песок раскладывают по 2 г на часовые стекла или стеклянные чашки Петри, затем смачивают его 1 мл раствора инсектицида и оставляют под тягой до полного испарения растворителя (не менее 12 ч). Следует учитывать, что при нанесении 1 мл 1 %-го раствора (т. е. 10 мг ДВ инсектицида в 1 мл ацетона) на 2 г сахара, концентрация инсектицида в приманке составляет 0,5 % (5 мг/г сахара).
В качестве емкостей для содержания мух используют марлевые садки размером (30 × 30 × 30) см или прозрачные полимерные емкости (бутылки) объемом 2 л. В последнем случае у бутылок срезают дно и закрывают его марлевыми салфетками. Салфетки закрепляют резиновыми кольцами. Бутылку кладут горизонтально, в горлышко помещают ватный тампон, смоченный водой, в середину бутылки – сахарную приманку на подложке (маленькие чашки Петри и т. п.).
В опыте используют мух, предварительно анестезированных эфиром или охлажденных в холодильнике. В контрольном варианте сахарный песок смачивают 1 мл ацетона. Проводят 3 опыта, используя в каждом не менее 5 концентраций инсектицида в 3 повторностях. В одну емкость помещают не менее 40 мух. Опыты проводят при температуре воздуха (23 ± 2) °С и относительной влажности 50—70 %. Смертность насекомых учитывают через 48 ч. Мух, лежащих на спине, неспособных самостоятельно перевернуться и ползать, относят к погибшим.

7.3. Методы определения уровня чувствительности к инсектицидам популяций комнатных мух, собранных на объектах
Комнатных мух отлавливают в помещениях, которые или постоянно обрабатываются инсектицидами, или предназначены для обработки. Возможен отлов мух и вне помещений. Выловленных мух содержат в течение суток при температуре (23 ± 2) ºС и влажности 50—70 % в марлевых садках. Если отловлено недостаточное для проведения эксперимента количество мух, то получают от них потомство, и опыты проводят на мухах 1-го поколения (F1). В опытах используют насекомых без разделения по полу.
7.3.1. Метод топикальной обработки
При определении уровня чувствительности собранных на объекте комнатных мух к инсектициду, для которого установлена диагностическая концентрация (доза) (табл. 7), в опыте используют ацетоновый раствор инсектицида этой концентрации. Проводят по три опыта в 3 повторностях, используя по 20 насекомых в каждой. Опыты сопровождают контрольным вариантом.
Если при обработке раствором инсектицида в диагностической концентрации остаются выжившие особи, то определяют значения СК50, % и СК95, % (СД50 и СД95, мкг/г) и показатель резистентности для данной популяции мух. Методика проведения опыта приведена в п. 7.1. При наличии в лаборатории стандартной чувствительной культуры комнатных мух, величины СК50 (СД50) или СК95 (СД95) определяют параллельно на насекомых, собранных на объекте, и чувствительных насекомых из культуры. В том случае если лабораторная культура отсутствует, используют для сравнения базовые показатели чувствительности (табл. 7).
Необходимо учитывать, что уровень чувствительности мух, собранных на объектах, может изменяться в течение сезона их активности, поэтому определение этого уровня следует проводить не менее двух раз в сезон и анализировать результаты в целом по сезону.
7.3.2. Метод скармливания отравленных приманок
Метод скармливания приманок с инсектицидом, введенным в диагностической концентрации, применяется для установления уровня чувствительности мух, собранных на объектах, к инсектицидам, обладающим кишечным действием (табл. 8).
При выживании насекомых в опыте проводят более точное определение уровня чувствительности по п. 7.2. Определяют значения СК50, и СК95 (мкг/г сахара), сравнивают их с таковыми для чувствительной лабораторной культуры или данными, приведенными в табл. 8, и определяют показатель резистентности.
8. Методы определения уровня чувствительности
к инсектицидам комаров родов Aedes, Culex и Anopheles
8.1. Метод установления исходного уровня чувствительности и диагностической концентрации ларвицидов для личинок комаров лабораторной чувствительной культуры
Опыты проводят по методу ВОЗ [14] на личинках комаров
p.p. Aedes, Culex или Anopheles лабораторных чувствительных культур. Личинок комаров третьего или в начале четвертого возраста рассаживают при помощи петли диаметром 5 см, обтянутой сеткой, по 20—25 особей в маленькие емкости (пробирки, мензурки), в которые налито по 24 мл дехлорированной воды, предварительно отстоянной в течение 24 ч. Личинок выдерживают в сосудах 2 ч, после чего удаляют погибших или ослабленных и заменяют их активными.
Приготавливают рабочие растворы необходимых концентраций, растворяя действующее вещество в спирте, а затем последовательно разбавляя водой, или же готовят водные эмульсии или суспензии из соответствующих инсектицидных средств.
В сосуды емкостью 500 мл наливают по 225 мл дехлорированной водопроводной воды. В каждый сосуд вносят 1 мл раствора инсектицида и размешивают. Затем в приготовленные растворы переносят личинок вместе с водой из маленьких емкостей. Контролем служат личинки, помещенные в дехлорированную воду, в которую вносят 1 мл растворителя. Опыты проводят при температуре 22—25 °С. Сосуды с личинками во время проведения опыта должны находиться при рассеянном естественном освещении. Для стандартизации условий освещенности и биоритмов опыт начинают в 9—12 ч местного времени. Опыты с каждой концентрацией и контрольный вариант ставят в 3-кратной повторности. Учет смертности личинок проводят через 24 ч. В категорию погибших включают личинок, которые длительное время не всплывают на поверхность воды, и тех, которые не ныряют при колебании воды.
8.2. Метод определения уровня чувствительности к ларвицидам личинок комаров, собранных на объектах
Личинок комаров собирают в природных биотопах или в подвалах домов при помощи водного сачка или кюветы согласно МУ 3.5.2.705—98 или МУ 3.2.974—00 [7, 8]. Для опытов отбирают личинок одного вида III (начала IV) возраста. Приготавливают спиртовой раствор ДВ инсектицида в диагностической концентрации или водную эмульсию или суспензию, приготовленную из препаративной формы в рекомендуемой диагностической концентрации. Опыт проводят по п. 8.1.
8.3. Метод установления уровня чувствительности и диагностической концентрации инсектицидов для имаго комаров лабораторной чувствительной культуры
Метод определения уровня чувствительности (резистентности) имаго комаров к инсектицидам был разработан ВОЗ [14]. Наборы для проведения опытов состоят из 20 пластмассовых цилиндров длиной 125 мм и диаметром 44 мм. Восемь из них маркируют красной меткой и используют для контакта насекомых с инсектицидом, 2 (с зеленой меткой) – для контрольного варианта без инсектицида и 10 (с зеленой меткой) – для содержания комаров. Каждый цилиндр с одного конца затягивают ячеистой сеткой из нейлона. Кроме того, необходимо иметь 10 рамок с выдвижной заслонкой, каждая с выступающей винтовой нарезкой с обеих сторон и впускным отверстием на заслонке диаметром 20 мм. Внутреннюю поверхность цилиндров для содержания комаров выстилают чистой бумагой (12 × 15) см.
Комары контактируют с бумагой, импрегнированной растворами инсектицидов. Такая бумага предоставляется по заявкам ВОЗ или же готовится экспериментатором. Для этого листы фильтровальной бумаги (площадью 100 см2) разрезают на куски размером (12 × 15) см и на каждую наносят раствор инсектицида из расчета 100 мл/м2. После обработки бумагу развешивают и просушивают в течение 1 ч.
Комаров (по 15—25 самок) впускают в цилиндр для их содержания с помощью эксгаустера, который имеет внутренний диаметр 12 мм и эластичную трубку длиной 60 см. В каждый цилиндр для контакта с инсектицидом вводят пропитанную раствором инсектицида в диагностической концентрации бумагу, свернутую в трубочку так, чтобы она прилегала к стенкам, и закрепляют ее в таком положении зажимами. Комаров, осторожно выдувая из цилиндра для содержания, перегоняют в цилиндр для контакта с инсектицидами, присоединив его к свободной нарезке на обратной стороне рамки и выдвигая задвижку. Затем задвижку задвигают, отвинчивают цилиндр для содержания комаров и отставляют его в сторону. Цилиндры с комарами на время выбранных экспозиций оставляют стоять в вертикальном положении, засетченным концом кверху. По истечении экспозиции комаров в обратном порядке переводят в цилиндр для содержания и подсчитывают количество особей, впавших в состояние нокдауна. Через 24 ч подсчитывают количество погибших комаров.


8.4. Метод определения уровня чувствительности к инсектицидам имаго комаров, собранных на объектах
Имаго комаров отлавливают в природных биотопах или на объектах при помощи энтомологического сачка, эксгаустера или пробирки. Комаров выпускают в садок из марли, капрона или мельничного газа и содержат при температуре 22—25 ºС и относительной влажности 50—70 %. В случае низкой влажности воздуха (40 % и менее) садок с комарами следует накрыть влажной тканью. В садок ставят пузырек с ватным тампоном, пропитанным 10 %-м раствором сахара.
Имаго комаров для проведения опытов можно получить, выплаживая их из личинок, выловленных в природных биотопах. В этом случае вылетевших комаров подкармливают 10 % сахарным сиропом, а на 3—5-е сут. после окрыления кормят кровью на прокормителях – морских свинках, мышах или людях-донорах. Опыт проводят через 24—48 ч после кормления. Для проведения опыта используют только сытых самок одного вида.
Определение уровня чувствительности популяций, собранных на объектах, начинают с использования диагностических концентраций. Опыты проводят по методу ВОЗ (п. 8.3).
Поскольку метод ВОЗ по определению уровня резистентности требует специального оборудования, а импрегнированная бумага, используемая в методе, имеет короткий срок действия, что требует дополнительных регулярных ее закупок за рубежом, в ИМПиТМ был разработан экспресс-метод определения резистентности малярийных комаров к фосфорорганическим инсектицидам и ДДТ [6]. В экспериментах используются самки, выловленные на дневках. Кроме того, рекомендуется помимо тестирования самок, собранных на дневках, проводить тестирование молодых комаров в возрасте 0—2 дней, полученных из куколок, выловленных из контрольных водоемов.
Для приготовления импрегнированной бумаги рекомендуется использовать бумагу-ватман артикула 4 609 р., размером (15,0 × 10,5) см, разрезая ее на 4 равные части. С помощью пульверизатора бумагу, закрепленную на деревянной раме, опрыскивают водными эмульсиями или суспензиями препаратов на основе ДДТ или малатиона. Обработанную бумагу сушат в горизонтальном положении, затем помещают в цилиндры, закрытые прозрачными пластмассовыми крышками диаметром 4 см. Крышки должны быть двух типов: с отверстиями диаметром 1,3—1,5 см в центре крышки для запуска комаров и с мелкими отверстиями, размер которых не допускает вылета комаров. Крышка с мелкими отверстиями должна быть вверху, с одним большим отверстием – внизу. В каждый из собранных цилиндров через большое отверстие запускают по 15—20 комаров и цилиндр ставят вертикально на подставку большим отверстием вниз. Для ДДТ и малатиона рекомендуются 2 % рабочая жидкость и диагностическое время, равное 30 и 40 мин, соответственно.
8.5. Метод изучения раздражимости имаго комаров
Раздражимость комаров может быть вызвана воздействием самого действующего вещества инсектицида, компонентами, входящими в состав препаративной формы, а также может зависеть от уровня резистентности к инсектицидам. В работах В. П. Дробозиной и Н. И. Бонда­ревой [3] были установлены особенности поведения различных видов малярийных комаров после контакта с обработанной ДДТ поверхностью. У Аn. sacharovi и An. sundaicus агрессивность после контакта с обработанной ДДТ поверхностью увеличивалась в 2—6 раз, что способствовало усилению эпидемиологической значимости этих видов. У имаго комаров Аn. martinius и An. pulcherrimus найдены сезонные изменения как уровня резистентности, так и раздражимости [15]. Таким образом, раздражимость крайне важна при работе с эпидемиологически опасными видами комаров, поскольку она способствует перелету комаров из обработанных помещений (хлева, надворные постройки) в необработанные (жилые помещения).
Для определения раздражимости рекомендуется метод, предложенный ВОЗ и усовершенствованный ИМПиТМ. Фильтровальную бумагу обрабатывают из пульверизатора рабочим раствором инсектицида в концентрации, отобранной в первичном опыте. Исследования проводят через 1—2 сут. после обработки. В опыте используют не менее 50 имаго комаров. По окончании опыта подсчитывают распределение особей по степени раздражимости. Детальное проведение эксперимента и необходимое оборудование приведены в МУ 3.5.2.1759—03 [9].
9. Меры предосторожности при работе
с природными популяциями насекомых или
популяциями, собранными на объектах
Многие насекомые являются переносчиками возбудителей природноочаговых трансмиссивных болезней (малярия и чума, вирусные энцефа­литы и желтая лихорадка, трипаносомозы и риккетсиозы, туляремия и др.). Насекомые – переносчики возбудителей этих болезней – чрезвычайно широко распространены в различных экосистемах. Некоторые из них, получив возбудителя, сохраняют его в своем теле пожизненно и передают потомству. В связи с этим при сборе и последующей работе с природными популяциями насекомых или с популяциями, собранными на объектах, необходимо соблюдать меры предосторожности: необходимо работать в резиновых перчатках и халатах, эксгаустеры должны быть снабжены грушами или ватными фильтрами.
Насекомых, оставшихся в живых после проведения эксперимента, уничтожают кипящей водой, или замораживают в морозильной камере при – 20 °С и сливают в канализацию.